茯砖茶是一种后发酵茶（属黑茶类），是青藏高原、蒙古高原以及丝绸之路两侧的牧民日不可少的饮料，并被称为神秘之茶。民间常将其作为一种治疗腹泻的偏方，并有研究资料证明茯砖茶有很好的抗腹泻效果[1】。致泻的原因有多种，主要腹泻有渗透性腹泻、分泌性腹泻、渗出性腹泻（炎症性腹泻）及肠道运动功能异常性腹泻等，一般情况下细菌可能导致分泌性腹泻、渗出性腹泻。茶叶是一种纯天然饮料，含有多种活性成分，对微生物（包括细菌、病毒、丝状真菌等）具有广谱抗性，对多种病原微生物的生长有明显抑制作用。近年来，国内外的一些学者对茶叶具有抑菌作用的化学组分和机理有一定的研究2-5]，但有关茯砖茶的杀菌作用还鲜见报道。本研究选用常易引起动物腹泻的几种菌，探讨不同年份茯砖茶的水提取物对其抑菌效果，比较不同陈化程度的茯砖茶的抑菌活性，为分析茯砖茶的药理功效做些基础研究，对进一步扩大其销量具有十分重要的意义。一、材料与方法1．材料取湖南益阳茶厂于1996、2002和2009年3个不同年份生产的茯砖茶，分别粉碎后过20目筛备用。试验菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏杆菌（SaLnorzella）、溶血性链球菌（Streptococcus hemolyticus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus su,btilis）、志贺氏菌（Shigella），均由湖南农业大学食品科技学院微生物研究室提供。2．主要仪器与设备R-100旋转浓缩仪（郑州长城科工贸有限公司），H-2050R离心机（长沙市八方科学仪器有限公司），HH数显恒温水浴锅（金坛市金城国胜实验仪器厂），LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器（上海医用核子仪器厂），SW-CJ-2D名牌之星净化工作台（苏州净化设备有限公司），ZD-85荣华气浴恒温振荡器（长沙八方科学仪器有限公司），镊子、接种环、酒精灯、培养皿、无菌过滤头、铝质烘皿、规玻璃仪器、抽滤装置等。3．主要试剂酒石酸钾钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、三氯化铝等试剂均为分析纯。4．试验方法(1)茯砖茶水提物的制备。茯砖茶水提物的制备参照文献[6]，将茯砖茶粉碎，按茶水比1:15用沸水浸提茶叶30rmn，两层纱布过滤，滤液经4500 rpm离心15min后浓缩，制成相当于含茯砖茶原料l.Og/mL浓度的提取液，放入高压蒸气灭菌锅中，经121.3C、20min高压灭菌后，冷却备用。(2)培养基和茯砖茶水提物的药敏纸片制备。牛肉膏汤、琼脂培养基及药敏纸片的制备均参考文献[7]。(3)试验菌活化培养、活菌计数和供试菌液的制备按参照文献[ 8-9]。(4)药敏纸片法抑菌试验。按参照文献[10]。(5)最低抑菌浓度(MIC)的测定。按参照文献[11]略作优化，将配置的固体培养基在121.30C、O.lMPa条件下灭菌20min，当灭菌培养基冷却至60。C左右时，在无菌条件下准确量取不同体积的茯砖茶提取液加入固体培养基中，配制成浓度lOOmg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.13mg/mL、1.56mg/mL和0.78mg/mL的茯砖茶水提取液浓度系列培养基，每个浓度做3个重复。不加茯砖茶提取物液的培养基为阴性对照。冷却凝固后，每平皿加入O.lmL的菌悬液，涂匀，将细菌置于37C下培养24h，观察生长情况以不长菌的最低提取物溶液浓度为该提取物的最低抑菌浓度。 (6)茯砖茶茶多酚及黄酮类化合物含量测定参考文献[12]。二、结果与分析1．六种细菌培养物菌落形成单位的测定结果见表1。37C环境下培养24h，6种细菌培养物活菌数从大到小依次为大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、枯草芽孢杆菌。将各菌的菌原液稀释到105cfu/mL，根据各菌的活菌数排列，从大到小依次需稀释104倍、104倍、103倍、102倍、102倍和10倍。2．药敏纸片法测定茯砖茶提取物的抑菌效果结果见表2。2009和2002两年份生产的茯砖茶水提取物对不同供试细菌都有一定的抑制作用，而1996年生产的茯砖茶水提取物仅对大肠杆菌和沙门氏菌有抑制作用。2009年生产的茯砖茶水提取物对志贺氏菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到20.40mm:t0.87mm，其次是沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、溶血性链球菌、大肠杆菌，对大肠杆菌的抑菌圈只有10.95mm±0.53mm。2002年生产的茯砖茶水提取物对志贺氏菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径有18.10mm±0.91mm，其次是沙门氏菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。1996年生产的茯砖茶水提取物仅对沙门氏菌和大肠杆菌有抑制作用，且效果不太明显，对其他4种供试菌没有明显的抑制效果。综合来看，茯砖茶的保存时间越长，其抑菌效果越差。3．茯砖茶提取物的最低抑菌浓度( MIC)检测结果见表3。2009年生产的茯砖茶提取物对志贺氏菌的MIC值最小，为1.56mg/mL，2002年生产的茯砖茶提取物对志贺氏菌和沙门氏菌的MIC值最小，为3.13mg/mL，1996年生产的大肠杆菌和沙门氏菌的MIC值最小，为50mg/mL。4．茯砖茶主要化学成分的测定结果结果显示，不同年份茯砖茶的内含成分的差别很大，随着茯砖茶贮存时间的增加几种主要的化学成分相应减少，2009年生产的茯砖茶多酚类及黄酮类化合物含量分别为13.24%及6.12%，2002年生产的分别含有12.50%和6.48%．1996年生产的只有4.79%和2.21%，减少得较多。三、讨论茯砖茶中含有多种有效成分，如茶多酚、咖啡碱、多糖、维生素等。茶多酚具抗氧化、抑菌作用，特别对葡萄球菌、肠内细菌、肺炎杆菌、黄曲霉菌、金黄色链球菌等有显著的抑制作用[13]。黄酮类化合物是药用植物中一大类有效成分，具有多种生物活性，低浓度能抑菌，高浓度能杀菌[14]。本研究的结果显示2009年生产的茯砖茶抑菌效果最好，2002年的次之，1996年的茶最差，说明茯砖茶存放的时间越长其抑菌效果越差。茯砖茶在存放过程中，由于微生物作用、湿热作用和自动氧化作用等综合因素的影响，茶叶中的内含成分发生一系列变化，其中茶多酚和黄酮类的含量减少较多，这两种成分均是抑菌活性成分，因此导致茯砖茶越陈其抑菌效果就越差。提取物体外的抑菌强弱与提取物成分组成及浓度密切相关，但大多数药用植物水提取物浓缩至较高的浓度时，往往会变得粘稠，这种提取物成分复杂，常含有生物碱、黄酮类、鞣质及没食子酸的衍生物、有机酸等多种抗菌、抑菌成分，也有蛋白质、淀粉、多糖、树脂等无抑菌作用的成分㈣。本试验所用茯砖茶提取物，未作醇沉去杂，对各细菌的抑菌作用可能会有一定影响，显示仅对部分菌种有较强的抑菌作用。本研究采用药敏纸片法和二倍稀释法研究茯砖茶提取物抑菌效果，此两种方法均是测定抑菌作用大小的有效方法。药敏纸片法操作简便，抑菌圈直径大小也可作一种定量测定指标，但不够精确，可用于筛选药物；二倍稀释法是一种精确定量的方法，但操作较为复杂，可作为最后精确测定方法。总的来说，茯砖茶提取物对致腹泻微生物有较好的抑菌效果，说明茯砖茶对细菌性致泻有一定的抑制作用，但随着陈化时间越长，其抑菌效果越差。参考文献：[1]余智勇，黄建安，杨明臻，等．茯砖茶抗腹泻效果研粗．茶叶科学，2009，29(6)：465-469.[2] WU S C,YEN G C,WANG B S.Antimutagenic andantimicrobial activities of Pu-erh tea [JJ. Food Scienceand Technology,2007,40(3 ):506-512.[3] TIWARI R P,BHARII S l<,KAURH D,et aLYnaljsticantrmicrobial activity of tea and antibiotics[Jl. Inrlian J MedRes，2005，122: 80-84.[4] LEE H C,JENNER A M, LOW C S,et a1.Effect oftea phenolics and their aromatic fecal bacterial metaboliteson intestinal microbiota [J].Research in Microbiology,2006，157(9)：876-884.[5]唐裕芳，张妙玲，冯波，等，茶多酚的抑菌活性研究 [Jl．浙江林学院学报，2005，22(5)：553-557.[6]徐任生，陈仲良．中草药有效成分的提取和分离[Ml.上海：上海科技出版社，1993.[7]陈天寿．微生物培养基的制造和应用[M].北京：中国农业出版社，1995，89-102.[8]沈关心，微生物与免疫学[M].北京：人民卫生出版社．2003。310.“[9]沈萍主编．微生物学实验[M].北京：高等教育出版社．1999.[10]杨履渭，刘秉阳．微生物学及检验技术[M].广州：广东科技出版社，1992，440-447.[11]谢主兰，吴文龙．榕树叶抑茵作用的试验研究叨．食品研究与开发，2004，23(2)：7-9.[12]黄意欢，茶学实验技术[M].中国农业出版社，1995， 124-135．[13]宛晓春．茶叶生物化学[M].中国农业出版社，2003， 328-329．[14]俞佩芳，三种常见药物植物抗茵作用的探讨叨，华东师范大学学报（自然科学版），1994，8( 1)：89-93.[15]路振香．八味中药提取物的体外抑茵试验切．中兽医医药杂志，2005，(3)：37-39.