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[资料]红茶制造化学(二) 红茶制造中主要酶类活性变化及作用

[资料]红茶制造化学(二) 红茶制造中主要酶类活性变化及作用

红茶制造化学(二) 红茶制造中主要酶类活性变化及作用


 


红茶制造中主要酶类活性变化及作用


 


       茶鲜叶中的酶类很复杂,除在红茶加工中较重要的氧化还原酶类和水解酶类外,还有转移酶类,裂合酶类、异构酶类和合成酶类等。


 


一、酶在红茶制造过程中的变化


 


•红茶是全发酵茶,其品质特征的形成取决于鲜叶所含化合物的种类,其中对红茶风味影响最为重要的是多酚类(尤其是儿茶素类)和PPO。


 


•在红茶加工中,必需充分利用酶的生物化学作用,才能形成红茶“红汤红叶”的品质特征。


 


•以糖苷形式存在的键合态香气化合物前体(如香叶醇、芳樟醇、青叶醇等的糖苷)及其水解酶β-糖苷酶以及与C6-醛、醇等生成有关的亚麻酸、脂肪加氧酶及醇脱氢酶等对红茶香气生成也非常重要。


 


萎凋后续工序中氧化酶类活性的变化


 



 


Ø萎凋


 


•将采下的茶鲜叶薄摊(15-20cm厚),散失一部分水分的工艺处理过程。在逐步失水的萎凋过程中,叶子因失水使叶细胞汁相对浓度提高,叶细胞内各种酶系的代谢方向趋于水解作用。一部分水解酶如淀粉酶、蔗糖转化酶、原果胶酶、蛋白酶等活性都有提高。


 


•萎凋中酶活性的提高则与叶组织内部酸化有关。由于糖类物质降解成有机酸,酯型儿茶素酯解生成没食子酸,原果胶生成果胶酸,叶绿素水解有叶绿酸的形成等,使萎凋叶逐步向酸性转化,pH从鲜叶的近乎中性降低到5.1-6.0之间,与酶的最适pH相适应,使酶的活性增加。


 


•而茶鲜叶中酶的最适pH一般偏于酸性,如淀粉酶为5.0-5.4,蛋白酶为4.0-5.5,多酚氧化酶为5.0-5.5,过氧化物酶为4.1-5.0。此外,随叶子的逐步失水,酶及其作用物的相对浓度升高,结合态的酶,部分可转化为游离态。


 


•萎凋叶水解酶活性的提高,有利于促进鲜叶中一些高分子有机化合物的水解,提高萎凋叶中水溶性有效成分的含量。这些水解产物对红茶色、香、味的形成均有积极的意义。


 


•如以糖苷形式存在的结合型香气受水解酶β-糖苷酶水解,香气化合物游离出来。脂肪氧合酶使茶叶中不饱和脂肪酸如亚麻酸、亚油酸降解形成C6-醛等具有清气的挥发性化合物。


 


•萎凋中香气成分总量增至鲜叶原料的10倍以上,其中以顺-3-己烯醇、反-2-己烯醇、芳樟醇增加最多,一些非挥发性成分如氨基酸、咖啡碱在萎凋中也有所增加,这些成分对茶叶滋味有积极作用。


 


•萎凋中氧化酶活性的提高则为揉捻开始以后的发酵工序准备了良好的发酵条件。刘仲华等(1989,1990)报道,在0-16小时萎凋期间,随萎凋时间延长,多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性增至最大,如继续延长萎凋时间,酶活性开始下降。


 

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Ø揉捻(切)


 


•在揉捻过程中,茶叶组织损伤和细胞破损,膜透性增加,化学成分和酶得到混合,各种化学反应得以实现。


 


•由于茶多酚类是蛋白质的沉淀剂,易使许多酶失活或活性降低,如TCA循环酶系已基本失活。但由于茶多酚类化合物是PPO的作用基质,酶在自身的基质中变性较慢。其中,低分子量的PPO6立即消失,PPO4、PPO2也仅隐约可见,而PPO1、PPO3和PPO5活性基本保持不变,成为发酵期间起主导作用的酶蛋白组分。


 


•在揉切阶段,还包括脂肪氧合酶催化不饱和脂肪酸形成大量挥发性羰基化合物。


 


•但多酚类的酶促氧化及其后续的聚合、缩合作用,以及由此而引起的一系列伴随反应,是揉捻(切)和发酵工序中物质变化的主流。


 


•这个由萎凋的水解作用为主导到揉捻开始以后以氧化作用为主导的物质变化,决定着红茶品质特征的形成。


•萎凋过程中酶的活性变化,既与萎凋进程有关,又受温度影响。在同一温度下,萎凋时间延长,酶的活性升高;在不同温度下,萎凋温度增高酶的活性提高愈快。


 



 


Ø发酵


 


•发酵过程中,各种化学反应都很活跃,一些极为复杂的化学反应得到加速,其中最重要的是PPO和POD酶促的氧化作用,也包括β-糖苷酶水解反应的加速以及脂肪氧合酶的作用。


 


•发酵过程中,由于儿茶素的氧化,一部分酶与氧化的多酚类结合成不溶性复合物,使酶丧失催化机能。多酚基质的减少也会导致酶活性的降低。


 


•与萎凋叶相比,在发酵期间PPO和POD活性持续下降,但PPO的活性降低较POD快,这主要是由于发酵叶中有机酸的增加,pH降至5.0以下,使PPO丧失了最适pH条件,而POD的活性因酸度适宜而下降缓慢,使得PPO与POD的活性比值下降,POD逐渐居于主导地位,并对茶多酚氧化产物的形成和积累产生一定的影响。


 


•发酵期间,PPO同工酶带中,PPO1始终保持相对较强的活性,其它几条酶带活性则逐渐减弱;而POD同工酶的变化主要表现在低分子量、迁移率较大的酶蛋白组分上,萎凋叶一经揉捻,POD7、POD8、POD9及POD10等4条酶带即消失或仅隐约可见,分子量较高的组分POD2和POD3热稳定性好,对多酚的敏感性差,活性受影响较少,至发酵完毕仍保持相当的活性,是发酵过程中起主要作用的酶带。


 


•发酵酶活还受鲜叶萎凋程度、萎凋温度及发酵温度的影响。


 


•当萎凋叶含水量低于68%时,随萎凋叶的失水,发酵叶中酶的活性明显下降,重萎凋的萎凋叶酶活性高,但叶内茶多酚浓度大,发酵时酶蛋白与氧化了的茶多酚产生不可逆沉淀增加,使其活性下降。只有适度轻萎凋,可保持发酵过程PPO的较高活性。


 


•萎凋时温度过高,酶活性虽然迅速激活增加,但维持活化的时间较短,到了揉捻发酵过程就会显著下降,不利于多酚类的酶促氧化。


 

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Ø干燥


 


•发酵工序结束,酶所担负的使命已经完成,此时务必迅速终止酶的作用,才能保证在良好发酵条件下所形成的优良品质,而进入干燥工序。


 


•高温能使酶产生不可逆热变性,但在较低温度下,温度如升高,反而会促进酶的催化能力。


 


•干燥初期,当叶温升高到约45-50℃时,酶的催化作用十分强烈,能使部分多酚类在短时间内迅速氧化;叶温达到70-80℃时,酶处于热变性状态,催化机能停止,但不一定都成不可逆的热变性;80-100℃时,经过一定时间,酶的生物学特性才会彻底终止。因此,要保持茶叶各项有效品质成分,干燥前阶段叶温必须在80℃以上,并辅以充分排湿。


 


•红茶干燥一般为二次干燥,第一次以90-95℃热风将茶 坯烘至含水量15%-25%,称打毛火。下机摊凉散热,冷却至室温。再进行第二次烘干至含水量为5%-6%,称为打足火。


 


•毛火干燥对PPO和POD的失活作用较明显,分别降至萎凋叶的8%和7.5%左右。


 


•足火干燥后,毛茶中的PPO和POD活性仍有残余,分列为0.4%及4.0%。这主要是高分子量、热稳定性强的PPO1、POD2和POD3,即在发酵过程中起主要作用的并在成茶中残余的均是那些热稳定性好,对多酚敏感性差的高分子酶蛋白组分。

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二、红茶制造过程中重要的酶


 


•在红茶制造过程中涉及到多种酶的催化作用,特别是水解酶和氧化还原酶,它们对红茶品质的形成起了关键的作用。


 


Ø多酚氧化酶(邻苯二酚:O2氧化还原酶,E.C.1.10.3.1;PPO,polyphenol oxidase)


 



 


•PPO在红茶制造过程中将黄烷醇类氧化成醌,形成的醌再经氧化缩合成更复杂的发酵产物如茶黄素、茶红素和茶褐素。


 


•PPO是一种分子量为144,000±16,000的含铜离子作为辅基的酶,其含铜量达0.260%,在279nm和611nm处有2个吸收峰。


 


•PPO有6个同工酶带,各同工酶比整个酶复合体对底物的专一性更强,它们对各种儿茶素或简单酚类的催化氧化速率不同。


 


•PPO最佳底物为邻位酚如儿茶素等,不能催化单元酚、对苯二酚及抗坏血酸等。


 


•PPO最适温度为35℃。最适pH则与底物酚羟基的数目和数量有关,在以邻苯二酚为底物时为5.7,以4-甲基邻苯二酚为底物时为5.0。


 


•PPO可被氰化钾、叠氮化钠、一氧化碳和硫化氢等抑制。


 


•一般认为多酚氧化酶局限在叶表皮细胞内,其在地上部分活性以嫩茎最高,其次是幼嫩芽叶,成熟叶较低。并且PPO活性以适制红茶的品种高于适制绿茶的品种,夏季高于春季。


 


Ø过氧化物酶(供体:H2O2氧化还原酶,E.C.1.11.1.7;POD, peroxidase)


 



 


•是在过氧化氢存在下催化基质氧化的一种酶,它不能利用空气中的氧气。


 


•分子量为40,000,铁卟啉为辅基,属于亚铁血红蛋白质类。有9-10条同工酶。


 


•底物较PPO广泛,包括单元酚、邻苯二酚、连苯三酚、抗坏血酸、色氨酸、酪氨酸和组氨酸等。


 


•最适pH4.1-5.0。


 


•在植物体内,可被乙烯、吲哚乙酸激活,而氰化钾、S2-、羟胺及氟化物可抑制其活性。


 


•POD也参与红茶色素形成的发酵途径。


 


Ø醇脱氢酶(醇:NAD氧化还原酶,E.C.1.1.1.1;ADH, alcohol dehydrogenase)


 



 


•存在于茶叶和茶籽中。也叫烟酰胺醇脱氢酶,可催化脂肪族或芳香族醇及醛类的氧化还原反应。


 


•其分子量为95,000,由2个分子量为47,000的无活力的同质亚单位组成,活性中心为锌,辅因子为NAD。最适pH7.9。对脂肪族、萜类催化活力较高。邻菲罗啉、单碘醋酸可抑制其活性。


 


Ø脂肪氧合酶(亚油酸:O2氧化还原酶;E.C.1.13.11.12;LOX, lipid oxidase)


 



 


•也叫脂肪氧化酶、脂肪加氧酶、亚油酸-氧化还原酶。催化含顺,顺-1,4-戊二烯的不饱和脂肪酸及酯的加氧反应,氧化形成具有共轭双健的过氧化合物。


 


•LOX位于叶绿体片状结构中,生物合成有赖于叶绿体中蛋白质的生物合成,茶无性系中的LOX至少存在两种同工酶。该酶是一种含非血红素铁的蛋白质,分子量为73,000±2100。最适pH6.5-7.0,最适温40-45℃。抗坏血酸、EDTA和槲皮素均可抑制其活性。


 


•LOX活性随茶鲜叶成熟度和季节不同而有差异,新梢成熟度越高,则脂肪氧合酶活性越高。光、温和伤害均可提高其活性,所以,采后鲜叶LOX活性有所升高。


 


Ø叶绿素酶(叶绿素:叶绿素酸酯水解酶,E.C.3.1.1.4,chlorophyllase )


 



 


•催化叶绿素水解形成脱植基叶绿素。


 


•有2条同工酶带。其最适pH5.5,最适温45℃。它与制茶中的色泽形成有关。萎凋后发酵形成的酸性环境,使叶绿素脱镁,有利于形成红茶所要求的色泽。


 


Ø糖苷酶


 


•β-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.21;β-葡萄糖苷水解酶, β- glucosidase)


 


可以水解结合于末端、非还原性的β-D-葡萄糖苷键,同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。该水解反应在红茶加工的萎凋工序中开始,揉捻和发酵阶段加速,主要水解产物有顺-3-己烯醇和苯甲醇。其中顺-3-己烯醇以葡萄糖苷的形成存在,而苯甲醇的前体既有以葡萄糖苷形式也有以樱草糖苷的形式存在。


 


•樱草糖苷酶(primeverosidase):将樱草糖苷水解为樱草糖和相应的配基。


 


Ogawa等(1997)用与Guo等(1996)相同的方法研究了水仙种中β-樱草糖苷酶的性质,用SDS-PAGE测定其是一分子量为61Kda的单体蛋白,等电点为9.5,最适温45℃,最适pH4.0。40℃以下,pH在3-5以内稳定。


 


其它还有:


 


•肽酶催化蛋白质的多肽链水解而形成氨基酸和多肽链,与红茶风味有关;


 


•果胶酯酶水解果胶素生成果胶酸,可降低环境pH,利于其它酶系的作用,且果胶具有一定的粘度及厚味感,与茶叶外形及滋味有关。

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